2. 實驗部分

2.1. 材料

純重組人胰島素、甲醇、氯仿和鹽酸從MP Biomedical，LLC（Solon，OH）獲得。 重組人胰島素（Catalog#199744，99.3%分析）已在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生，并使用親和純化進(jìn)行純化。 所有化學(xué)品均為試劑級，使用時無需進(jìn)一步純化。 用于子階段制備的水來自Modulab 2020水凈化系統(tǒng)（德克薩斯州圣安東尼奧大陸水系統(tǒng)公司）。 純化水的表面張力為72.6 mN·m ? 1在20.0±0.5°C，電阻率為18 MΩ·cm，pH值為5.6時。

2.2. 方法

FITC人胰島素結(jié)合程序。 通過FITC-HI的表觀熒光檢測HI-Langmuir單層的形貌。 由于胰島素是非熒光的，所以必須附加一個熒光團(tuán)才能使用熒光顯微鏡。 常用的蛋白質(zhì)探針是異硫氰酸熒光素（FITC）。

FITC共軛HI的制備方法如下。 在PBS溶液中分別制備FITC（1 mg/mL）和HI（0.3 mg/mL）溶液。 用鋁箔覆蓋FITC溶液和任何含有FITC的溶液，以防止熒光探針的光降解。 將FITC溶液逐滴加入胰島素溶液中并攪拌1小時。 這兩種溶液在FITC與胰島素的摩爾比為0.5:1至4:1的范圍內(nèi)相互混合。 攪拌后，溶液通過G-25 Sephadex柱（球狀蛋白范圍：1×103至5×103 Da）按以下順序按重量分離：FITC-HI、HI和FITC。 當(dāng)流經(jīng)葡聚糖凝膠柱的其中一種組分的質(zhì)量高于該范圍時，這些組分將首先流出。 G-25葡聚糖凝膠的最大范圍為5000da； 然而，HI的摩爾質(zhì)量為5870 g mol ? 1. 三個組成部分中有兩個高于5000 Da，即HI-FITC和HI。 因此，最重的組分HI-FITC將首先流出色譜柱，然后流出HI。 最輕的成分是FITC和FITC碎片，它們保留在柱的頂部，如柱頂部的亮綠色發(fā)光所示。 柱上的紫外光顯示三個不同區(qū)域：柱底部附近的熒光綠色區(qū)域，對應(yīng)于FITC-HI，其上方的非熒光部分對應(yīng)于未共軛于FITC的HI，以及柱頂部的熒光黃色區(qū)域，對應(yīng)于未共軛于HI的FITC。 使用PBS緩沖液運行色譜柱，收集體積為1mL的等分試樣。

熒光光譜法用于選擇含有FITC-HI的小份樣品。 FITC探針在494nm激發(fā)時顯示出517nm的發(fā)射。 人們注意到，當(dāng)探針與HI共軛時，F(xiàn)ITC發(fā)射的強度增加。 吸收光譜法用于確定HI與FITC的比率，該比率由下式計算得出。21

其中MolWtHI=5870 g mol ? 1和ε280，HI和ε495，F(xiàn)ITC分別為17335和90000。 A495和A280分別是共軛物和HI在494和280 nm處的吸光度。 考慮到FITC在280 nm處的吸光度，校正系數(shù)為0.35×A495。 制備了各種共軛物（FITC x-HI），x代表每HI結(jié)合的FITC分子的平均數(shù)量。 一個已經(jīng)準(zhǔn)備好了1個 ? 10個FITC分子與HI分子相連，但具有1個FITC分子的HI共軛物主要用于表觀熒光顯微鏡實驗。

朗繆爾單層制備。 Langmuir單層實驗中使用的HI溶液濃度為0.30 mg/mL，通過將HI粉末溶解在鹽酸水溶液（pH 2）中制備。 對于作為朗繆爾單層進(jìn)行的所有實驗，亞相（純水）的pH值為5.6。 Kibron槽和KSV槽的鋪展液體積分別為80和40μL。 HI溶液在空氣中擴(kuò)散 ? 水界面，使用100μL注射器（Hamilton Co.，Reno，Nevada），在亞相表面均勻沉積小液滴，然后等待15分鐘，以使Langmuir單層達(dá)到平衡。 壓縮率設(shè)定為10mm·min ? 1. 所有等溫線和原位紫外光譜 ? 在溫度（20.0±0.5℃）和濕度（50±1%）保持恒定的潔凈室（1000級）中進(jìn)行可見光、熒光和輻照光譜測量。

表面化學(xué)和光譜學(xué)方法。 使用面積為5.9 cm×21.1 cm的Kibronμ-槽（Kibron Inc.，芬蘭赫爾辛基）測量表面壓力 ? 面積（π） ? A） 等溫線 ? 減壓周期和穩(wěn)定性研究。 表面電位 ? 面積（ΔV ? A） 使用由電容式系統(tǒng)組成的開爾文探針在Kibron槽上獲得等溫線。 振動板設(shè)置在朗繆爾單層表面上方約1 mm處，鍍金槽底座用作對電極。

空氣中的光譜測量 ? 使用HP 8452 A型紫外分光光度計獲得水界面 ? vis和Fluorog-3熒光分光光度計（Horiba Scientific，愛迪生，新澤西州）用于熒光。 HI-Langmuir單層膜在空氣中的熒光光譜 ? 使用面積為0.25 cm2的分叉光纖測量水界面，并將其放置在亞相表面上方1 mm處。 激發(fā)光通過光纖從光源傳輸?shù)嚼士姞枂螌幽?，朗繆爾單層膜的發(fā)射光通過光纖傳回檢測器。 紫外線 ? 在Perkin Elmer Lambda 900 UV/vis/NIR光譜儀（Norwalk，CT）和Fluorog-3熒光光譜儀（與用于Langmuir單層的熒光光譜儀相同）上分別使用1 cm光程長度的石英反應(yīng)杯記錄水溶液的可見吸收光譜和熒光光譜。

表觀熒光顯微鏡用于觀察Langmuir單層（如有）中區(qū)域的形成。 顯微鏡需要在樣品臺頂部放置朗繆爾槽。 石英窗允許激發(fā)光穿透亞相，以便在空氣中激發(fā)熒光團(tuán) ? 水界面。 實驗裝置使用Kibronμ-槽（Kibron Inc.，芬蘭赫爾辛基）和熒光顯微鏡（Olympus IX-FLA）相結(jié)合。 可用于鋪展溶液的面積為5.9 cm×21.1 cm。 該熒光圖像由熱電冷卻光電Magnafire CCD相機(jī)拍攝。

布魯斯特角顯微鏡（BAM）用于觀察朗繆爾單層的形貌。 使用IElli-2000成像橢偏儀在關(guān)閉補償器和BAM2plus軟件的情況下進(jìn)行測量。 IElli2000系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)激光器是倍頻Nd:YAG激光器（50 mW輸出），使用532 nm線。

使用JASCO J-810分光旋光儀獲得圓二色性（CD）光譜。 在25°C下，使用2.0 mm光程長度的石英電池，在195和250 nm之間記錄光譜。

水溶液的紅外光譜是使用衰減總反射率獲得的。 使用生物ATR輔助裝置，將水樣沉積在ATR晶體表面，很容易獲得紅外光譜。 靜態(tài)模式只需要15分鐘 ? 20μL水溶液； 但是，水溶液的濃度應(yīng)大于0.5 mg/mL，以確保與ATR晶體適當(dāng)接觸。 水銀 ? 鎘 ? 碲化物（MCT）探測器（Kolmar Technologies）的掃描速度為5 kHz。 背景光譜為純水。 將生物ATR細(xì)胞II置于Bruker Optics Equinox55 FTIR的細(xì)胞室中。

紅外反射 ? 使用EQUINOX-55傅里葉變換紅外（FTIR）光譜儀（Bruker Optics，Billerica，MA）對Langmuir單層進(jìn)行吸收光譜（IRRAS）測量，該光譜儀配備適用于空氣的XA-511外部反射附件 ? 水界面實驗。 紅外光束聚焦在空中 ? Kibronμ-槽的水界面。 反射的紅外光束進(jìn)入了由液氮冷卻的HgCdTe（MCT）探測器。 獲得的光譜分辨率為8 cm ? 1通過對1200個p極化掃描和800個s極化掃描的疊加。

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學(xué)和光譜學(xué)性質(zhì)——摘要、介紹

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學(xué)和光譜學(xué)性質(zhì)——實驗部分

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學(xué)和光譜學(xué)性質(zhì)——結(jié)果和討論

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學(xué)和光譜學(xué)性質(zhì)——結(jié)論、致謝！