摘要

我們研究了親水聚合物（HPs）逆轉(zhuǎn)白蛋白抑制作用和恢復(fù)脂質(zhì)蛋白肺表面活性劑制劑（LSP）表面活性的能力：Curosurf和Survanta。暗示的HPs是葡聚糖和聚乙二醇10000（PEG1000）。在空氣/水界面的薄膜（單層和泡沫）中評(píng)估LSP的表面活性。白蛋白從界面上取代LSP，并抑制其在單層中維持低表面張力和形成穩(wěn)定的泡沫薄膜（FF）的能力。當(dāng)HPs添加到單層中時(shí)，它們恢復(fù)LSP的表面活性并恢復(fù)其維持低動(dòng)態(tài)表面張力的能力。類似地，泡沫膜中HPs的加入導(dǎo)致白蛋白效應(yīng)的中和，并形成具有均勻表面的穩(wěn)定薄膜（厚度<17 nm），如純LSP的情況。我們的發(fā)現(xiàn)允許我們尋找一個(gè)有趣問(wèn)題的答案，為什么PEG更好地恢復(fù)了Survanta的表面活性，而葡聚糖-則恢復(fù)了Curosurf的表面活性。這些結(jié)果可能對(duì)成人呼吸窘迫綜合征的治療具有重要意義。

介紹

肺表面活性物質(zhì)（LS）是一種復(fù)雜的脂質(zhì)-蛋白質(zhì)混合物，在肺泡表面形成各種薄膜。它的主要功能之一是在呼氣時(shí)壓縮肺表面時(shí)達(dá)到較低的表面張力，并防止肺泡塌陷。

許多外源表面活性劑制劑（ESP）能夠在純空氣/水界面快速吸附并降低其表面張力。由于其高表面活性，這些制劑在治療特發(fā)性呼吸窘迫綜合征（一種新生兒患有表面活性劑不足且肺泡空氣/水界面“純凈”且“開(kāi)放”以補(bǔ)充表面活性劑的疾病狀態(tài)）方面是有效的。然而，最近另一種病理學(xué)正在增加其發(fā)病率：所謂的成人呼吸窘迫綜合征（ARDS）。在ARDS患者中，肺泡內(nèi)發(fā)生血液滲漏，空氣/水界面被吸附的血漿蛋白，尤其是最豐富的血液蛋白血清白蛋白“阻斷”。目前可用的ESP對(duì)于ARDS治療是無(wú)效的，因?yàn)樗鼈儾荒軓谋砻嬷脫Q白蛋白分子，并且不能吸附和降低表面張力。因此，迫切需要找到一種調(diào)整ESP界面性質(zhì)的方法，以恢復(fù)藥物制劑在白蛋白存在下的表面活性。

在目前的工作中，我們研究了兩種ESP（Survanta和Curosurf）在被吸附的牛血清白蛋白（BSA）阻擋的空氣/水界面的薄膜中的表面行為。所采用的薄膜是單層和泡沫膜。單層張力測(cè)定法用于測(cè)量表面活性劑制劑壓縮單層表面積后獲得的最小表面張力γmin。泡沫膜（FFs）由兩個(gè)相互粘附的頭對(duì)頭脂質(zhì)蛋白單層組成。雖然FFs被認(rèn)為是（1）體外評(píng)估肺表面活性物質(zhì)制劑界面性質(zhì)的有力工具，但這是FFs首次用于研究白蛋白對(duì)ESP表面行為的影響。

ESP使用純的且在非表面活性親水聚合物（HPs）葡聚糖和聚乙二醇10000（PEG1000）存在下。選擇這些HPs是因?yàn)樗鼈儽徽J(rèn)為通過(guò)正耗盡吸引滲透壓的機(jī)制防止白蛋白誘導(dǎo)的表面活性劑抑制（2）。

材料和方法ESP（Survanta和Curosurf）從生產(chǎn)商處獲得。NaCl、牛血清白蛋白（BSA）、PEG 10000和右旋糖酐（Mw 79 400）購(gòu)自“西格瑪”。所有溶液均采用超純?nèi)ルx子水（電導(dǎo)率小于0.1μS）制備。

單分子膜在朗繆爾槽（表面積118 cm2）中形成單分子層，并使用微槽X張力計(jì)（Kibron Inc.，芬蘭）使用鉑絲探針通過(guò)Wilhelmy方法測(cè)量表面張力。使用兩種亞相：（i）表面張力為72.9mN/m的純鹽水溶液——用于純空氣/水界面的對(duì)照實(shí)驗(yàn)；（ii）表面張力約為50mN/m、溶解白蛋白（2mg白蛋白/ml）的鹽水溶液。當(dāng)暗示葡聚糖或PEG 10000時(shí)，它們?cè)趤喯嘀腥芙庵?%的最終濃度。在該量下，HPs不會(huì)改變?nèi)芤旱谋砻鎻埩?。通過(guò)Hamilton microsyringe將ESP制劑（在沒(méi)有和存在HPs的情況下）作為脂質(zhì)體懸浮液分散在空氣/水界面上。大約用了一個(gè)小時(shí)來(lái)準(zhǔn)備在界面上傳播。然后進(jìn)行十次連續(xù)的面積壓縮/減壓循環(huán)，其中單層被壓縮在118cm2（初始表面積）和23.6cm2（初始表面面積的20%）之間。壓縮速度為140mm/min。記錄了在最小單層表面積下獲得的最小表面張力γmin（mN/m）。

泡沫膜如前所述（3），在Scheludko和Exerowa的測(cè)量池中形成微觀泡沫膜。通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡觀察它們，并通過(guò)干涉測(cè)量技術(shù)測(cè)量膜厚度h（nm）。FFs的照片由Olimpus C-7070寬變焦相機(jī)拍攝。

結(jié)果和討論

單層

當(dāng)在純空氣/水界面擴(kuò)散時(shí)，ESP、Curosurf和Survanta在十個(gè)區(qū)域壓縮/減壓循環(huán)中達(dá)到并保持低于10 mN/m的最小表面張力（圖1）。

圖1.Curosurf（上圖）和Survanta（下圖）單層的最小表面張力（γmin）對(duì)壓縮/減壓循環(huán)次數(shù)的依賴性。符號(hào)表示：□-純空氣/水界面處的ESP（鹽水溶液亞相上）；在BSA亞相上的x-ESPs（2mg/ml）；■-在BSA（2mg/ml）和5%葡聚糖的亞相上進(jìn)行ESPs；▲-在BSA亞相（2mg/ml）和5%PEG 10000上進(jìn)行ESP。ESP作為脂質(zhì)體懸浮液擴(kuò)散，最終濃度為15μg磷脂/ml。實(shí)驗(yàn)在0.15 M NaCl、pH 6.8-7.0、T=25℃下進(jìn)行。

白蛋白的存在損害了制劑的表面性質(zhì)，兩者的γmin約為30mN/m。單層亞相中HPs的存在允許恢復(fù)ESP維持低γmin值的能力。葡聚糖在恢復(fù)Curosurf的表面活性方面比PEG 10000更有效（圖1上圖）?？梢钥闯?，在PEG存在下，Curosurf在第一次壓縮/減壓循環(huán)期間達(dá)到20mN/m的最小表面張力，該最小表面張力隨著循環(huán)次數(shù)不斷增加，直到達(dá)到大于30mN/m。相反，當(dāng)葡聚糖包含在亞相中時(shí)，Curosurf表現(xiàn)出與純空氣/水界面相同的行為，并在所有連續(xù)循環(huán)中保持γmin=9 mN/m。

與上述結(jié)果相反，在Survanta的情況下，PEG 10000比葡聚糖更有效（圖1下圖）。在葡聚糖存在下，Survanta獲得了20mN/m的γmin（第一次循環(huán)），在隨后的循環(huán)中增加到30mN/m以上。PEG的加入允許Survanta在第一次循環(huán)中達(dá)到9 mN/m的最小表面張力（與純空氣/水界面處的值相同），盡管在隨后的循環(huán)中（第8次至第10次循環(huán)）它上升到20 mN/m的平臺(tái)值。有必要將Survanta的體積濃度增加到200μg PL/ml，以便在所有壓縮/減壓循環(huán)期間保持約10mN/m的γmin（數(shù)據(jù)未顯示）。

純空氣/水界面處的泡沫膜Curosurf形成厚度為15 nm的穩(wěn)定普通黑色膜，而Survanta形成由薄黑色區(qū)域（h=17 nm）組成的異質(zhì)FFs，其中較厚區(qū)域被困在膜內(nèi)（圖2）。向ESPs中添加HPs不會(huì)改變?cè)诩兛諝?水界面處形成的黑色膜的類型和厚度。

圖2 ESPs形成的普通黑色薄膜。實(shí)驗(yàn)在250μg磷脂/ml 0.15 M NaCl、pH 6.8-7.0、T=25℃下進(jìn)行。

當(dāng)白蛋白存在于膜芯中時(shí)，ESP形成黑色膜的能力受到抑制，并形成厚（h>100nm）異質(zhì)膜（圖3A和4A），類似于由純白蛋白溶液形成的FFs。

通過(guò)Curosurf和白蛋白將PEG 10000包含到混合FFs中不會(huì)改變膜類型，并且FFs仍然厚且不均勻。相反，葡聚糖的加入導(dǎo)致了顯著的變化：觀察到薄膜變薄且穩(wěn)定的黑色薄膜（h=15 nm），類似于在沒(méi)有白蛋白的情況下通過(guò)Curosurf獲得的薄膜（圖3）。

圖3.在250μg磷脂/ml、0.15 M NaCl、pH 6.8-7.0、T=25℃條件下，通過(guò)Curosurf和BSA進(jìn)行混合FFs以及添加葡聚糖對(duì)膜形態(tài)的影響實(shí)驗(yàn)。

當(dāng)通過(guò)Survanta和白蛋白添加到混合FFs中時(shí)，葡聚糖不會(huì)改變膜的性質(zhì)。然而，當(dāng)FFs中包含PEG 10000時(shí)，富含白蛋白的厚膜分解成更小的厚“島”，島之間有薄的（h=17 nm）黑色區(qū)域（圖4）

圖4.通過(guò)Survanta和BSA的混合FFs以及PEG 10000添加對(duì)膜形態(tài)的影響。黑色區(qū)域的厚度為17nm。實(shí)驗(yàn)在250μg磷脂/ml、0.15 M NaCl、pH 6.8-7.0、T=25℃下進(jìn)行。

討論和結(jié)論

白蛋白抑制外源表面活性劑制劑在空氣/水界面的表面活性。當(dāng)BSA出現(xiàn)在膜液相中時(shí)，Curosurf和Survanta都失去了在單層中保持低最小表面張力和形成黑色泡沫膜的能力。

通過(guò)ESP和白蛋白將親水聚合物包含在混合薄膜中，恢復(fù)了藥物制劑的表面活性，ESP從空氣/水界面置換了白蛋白。后者導(dǎo)致（i）單分子膜中ESP低γmin值的恢復(fù)，以及（ii）ESP形成黑色泡沫膜的能力的恢復(fù)。

值得注意的結(jié)果是，兩種親水性聚合物葡聚糖和PEG 10000在BSA存在下恢復(fù)ESPs表面性能的效率不同：葡聚糖對(duì)Curosurf更有效，PEG 10000-對(duì)Survanta更有效。這表明HP的影響不僅可以用正滲透壓來(lái)解釋，還可能與聚合物對(duì)本體表面活性劑聚集體結(jié)構(gòu)的不同影響有關(guān)（4）。

當(dāng)前工作的重要影響是首次實(shí)施自由流，以研究白蛋白和親水聚合物對(duì)ESP表面行為的影響。

致謝

我們感謝保加利亞教育和科學(xué)部撥款DVU01/0406提供的財(cái)政支持。