1.3.3.5活性巰基含量

參照Ellman和Guo Xiaoya等的方法并加以修改。利用磷酸鹽緩沖液將3種肌漿蛋白的質(zhì)量濃度統(tǒng)一稀釋到1 mg/mL，取5 mL置于離心管中，加入20μL DTNB，在渦旋儀上充分振蕩后于室溫（25℃）孵育1 h，將孵育完成后的樣品滴入透明的96孔板中，在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。巰基含量按下式計(jì)算：

式中：C0為巰基含量/（mol/g）；A為412 nm波長(zhǎng)處的吸光度；ε為摩爾消光系數(shù)（13 600 L/（molgcm））；D為稀釋倍數(shù)；ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.3.6差示掃描量熱法

參考Vieira等方法并加以修改。差示掃描量熱法是了解生物系統(tǒng)在原生狀態(tài)下熱活動(dòng)的有利工具。將3種肉的肌漿蛋白溶液置于凍干機(jī)中凍干，然后分別稱(chēng)取樣品15 mg，密封在鋁盒中并放入樣品池，以空盒作參比，保護(hù)氣為氮?dú)?，升溫速?℃/min，溫度范圍20～110℃。

1.3.4蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性分析

參照Kristinsson等的方法并加以修改。利用6.0 mol/L的鹽酸胍溶液將3種肌漿蛋白質(zhì)量濃度調(diào)到1 mg/mL后混合均勻，于25℃（室溫）測(cè)定樣品不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度，測(cè)定范圍為200～310 nm。由于構(gòu)象變化速率可以更直觀地反映蛋白質(zhì)構(gòu)象柔順性，構(gòu)象變化速率按下式計(jì)算：

1.3.5肌漿蛋白界面行為及乳化性質(zhì)分析

1.3.5.1蛋白界面吸附動(dòng)力學(xué)

參考Gao Zhiming等方法，取大豆油500 mL，加入15 mL的Florisil吸附劑，攪拌30 min后，在5 000hg離心20 min；取出離心后的上清液繼續(xù)加入吸附劑，重復(fù)上述操作3次即得到純化后的大豆油。利用界面流變儀測(cè)定純水的動(dòng)態(tài)界面張力，直到30 min內(nèi)界面張力值下降不超過(guò)0.5 mN/m即滿(mǎn)足要求。純化后的大豆油密度為0.917 5 g/cm3，純水與純化后大豆油的界面張力為（26.5f0.5）mN/m。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)分析肌漿蛋白的界面張力（π）隨著吸附時(shí)間的變化表征肌漿蛋白的界面吸附行為。測(cè)定在室溫下進(jìn)行，U形針浸入樣品槽，樣品槽放入25 mL相應(yīng)的肌漿蛋白溶液（0.2 mg/mL），并通過(guò)馬達(dá)控制形成10μL大小的油滴，測(cè)定時(shí)間為10 800 s。測(cè)試過(guò)程中，外界不應(yīng)有較大的振動(dòng)，以免對(duì)測(cè)定造成較大的干擾。

1.3.5.2肌漿蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性

參照李偉偉的方法并加以修改。

乳化活性：將3種肌肉的肌漿蛋白質(zhì)量濃度稀釋到1 mg/mL，然后加入30%體積的大豆油，在8 000 r/min轉(zhuǎn)速下剪切2 min后，從底部取20μL的乳化液置于50 mL離心管中，再加入1%的SDS溶液稀釋100倍，利用渦旋儀振動(dòng)5 s后，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。

乳化穩(wěn)定性：將上述制得的乳液在4℃靜置10 min后，從底部取20μL乳化液重復(fù)上述操作，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性的計(jì)算公式如下：

式中：T為濁度，T=2.303hA0；A0為500 nm波長(zhǎng)處的吸光度；A10min為樣品靜置10 min時(shí)在500 nm波長(zhǎng)處的吸光度，DF為稀釋倍數(shù)；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為光路徑1 cm；θ為油所占比例0.2。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值利用SPSS 22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Origin 8.0作圖。

2結(jié)果與分析

2.1 3種肉肌漿蛋白的氨基酸組成分析

表1不同種類(lèi)肉中肌漿蛋白的氨基酸含量

氨基酸的組成及排列順序影響蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)特性、生化活性以及加工特性。有些氨基酸有較強(qiáng)的疏水性，因此這些氨基酸很大程度上會(huì)增加蛋白質(zhì)的表面疏水性，進(jìn)而對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性產(chǎn)生影響。因此，蛋白質(zhì)在油-水界面穩(wěn)定性的諸多影響因素中，蛋白質(zhì)暴露于界面的氨基酸組成不容忽視，特別是苯丙氨酸和酪氨酸這些疏水性極強(qiáng)的氨基酸，對(duì)保持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)也起著重要作用。從表1可以發(fā)現(xiàn)，雞肉肌漿蛋白中這兩種氨基酸含量最高，且與其他兩種肌肉肌漿蛋白間有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2肌漿蛋白的基本理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果分析

表2不同種類(lèi)肉肌漿蛋白理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)涉及到蛋白質(zhì)在極性不同的兩相之間產(chǎn)生的作用，對(duì)于研究蛋白質(zhì)的性質(zhì)等具有重要意義。影響蛋白質(zhì)在油-水界面上吸附的因素有很多，主要是蛋白質(zhì)的氨基酸組成及其序列分布、形狀、分子粒徑、構(gòu)象、表面疏水性、電荷大小等。

溶解度是反映蛋白質(zhì)溶液狀態(tài)和聚集程度的重要參數(shù)，肌肉蛋白質(zhì)的溶解度是指在特定的提取條件下溶解于水溶液中的原蛋白質(zhì)百分比，它是溶質(zhì)（蛋白質(zhì)）和溶劑（水）之間平衡的表現(xiàn)，如表2所示，對(duì)于相同條件提取的蛋白，魚(yú)肉肌漿蛋白溶解度顯著最大達(dá)到（16.74f0.39）mg/mL（P＜0.05），而豬肉肌漿蛋白與雞肉肌漿蛋白均在9.5～10.6 mg/mL之間，后面的二者間溶解度無(wú)顯著差異（P＞0.05）。從粒徑的角度看，大粒徑極大可能在空間產(chǎn)生位阻，進(jìn)而削弱表面疏水性的提高帶來(lái)的擴(kuò)散速率增加。雞肉肌漿蛋白的粒徑為（231.7f7.74）nm，相對(duì)稍大于其他兩種肌漿蛋白，但是整體無(wú)顯著差異（P＞0.05），這一現(xiàn)象與吸附動(dòng)力學(xué)具有理論關(guān)聯(lián)性。蛋白質(zhì)電位是衡量體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，因?yàn)樗粌H反映顆粒所帶電荷的大小，而且還能表征顆粒間相互作用的強(qiáng)弱，Zeta電位越高，即所帶電荷數(shù)越多，體系就越穩(wěn)定。

3種肉肌漿蛋白Zeta電位分別為（-12.65f1.39）、（-13.64f1.57）、（-15.64f1.99）mV左右，其中魚(yú)肉肌漿蛋白的Zeta電位相對(duì)于其他兩種蛋白顯著較高（P＜0.05），Zeta電位不僅影響著肌漿蛋白質(zhì)分子間的相互作用，而且在蛋白質(zhì)的凝膠及乳化方面也有著顯著性的影響。不同肉類(lèi)肌漿蛋白間表面疏水性的差異可能是由于其氨基酸組成、亞基組成和蛋白構(gòu)象不同所導(dǎo)致，由于蛋白質(zhì)中苯丙氨酸和酪氨酸的疏水性極強(qiáng)，而由表1可知，雞肉肌漿蛋白中這兩種氨基酸含量都要高于其他兩種肌漿蛋白，所以這也很好地解釋了雞肉肌漿蛋白的表面疏水性在3種肌漿蛋白中最大。

表面疏水性同時(shí)又與其他指標(biāo)有著密不可分的關(guān)系，例如熱變性溫度，因?yàn)檫m當(dāng)?shù)臒崽幚頃?huì)造成肌漿蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)表面，從而使蛋白質(zhì)的表面疏水性增強(qiáng)，這樣就可以改善蛋白質(zhì)的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。3種肌漿蛋白熱變性溫度都較低，在40～55℃之間，其中魚(yú)肉肌漿蛋白變性溫度最高而豬肉肌漿蛋白最低，且豬肉肌漿蛋白熱變性溫度與雞肉和魚(yú)肉間差異顯著（P＜0.05），而雞肉與魚(yú)肉肌漿蛋白間的變性溫度無(wú)顯著性差異。所以在肌漿蛋白的研究中，如何根據(jù)不同蛋白的變性溫度差異，準(zhǔn)確控制熱處理的強(qiáng)度至關(guān)重要，本研究可給蛋白變性凝聚組裝類(lèi)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的參考。