1.3生物表面活性劑的特性分析

1.3.1生物表面活性劑的制備

將菌株XH-2在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)60h，經紗布初過濾的發(fā)酵液在4℃、10 000r·min-1下離心20min，取上清液用6mol·L-1HCl溶液調節(jié)pH值至2.0，用等體積的乙酸乙酯溶液萃取2次，合并有機相于旋轉蒸發(fā)儀上濃縮，將濃縮液倒入燒杯中，待自然揮發(fā)干后即得生物表面活性劑粗品。

1.3.2生物表面活性劑對溫度、pH值和鹽度的耐受性

將生物表面活性劑粗品配制成濃度為0.3g·L-1的溶液，分別在4℃、室溫、60℃、100℃條件下處理30min，冷卻至室溫，測定其表面張力。

用1mol·L-1HCl溶液或1mol·L-1NaOH溶液調節(jié)生物表面活性劑溶液的pH值分別為2、4、6、8、10、12，均于室溫下放置12h，測定其表面張力。

加入適量氯化鈉使生物表面活性劑溶液的鹽度分別為0%、1%、3%、5%、7%、9%，均于室溫下放置12h，測定其表面張力。

1.3.3臨界膠束濃度(CMC)的測定

用蒸餾水將生物表面活性劑粗品配制成不同濃度的溶液，在室溫下測定其表面張力。根據生物表面活性劑濃度與表面張力的變化曲線圖得出臨界膠束濃度。

1.3.4生物表面活性劑成分的初步鑒定

表面活性劑的鑒定：采用亞甲基藍-氯仿實驗。將生物表面活性劑粗品配制成濃度為0.3 g·L-1的溶液，取5 mL表面活性劑溶液，依次加入10 mL亞甲基藍和5 mL氯仿，充分混勻，靜置幾分鐘后觀察其顏色。若氯仿層顏色變深，而水層幾乎無色，表明樣品屬于陰離子型表面活性劑；若水層顏色變深，而氯仿層幾乎無色，表明樣品屬于陽離子型表面活性劑；若兩層顏色大致相同，且水層呈乳液狀，表明樣品屬于非離子型表面活性劑。

定性分析：將生物表面活性劑粗品配制成一定濃度的溶液，用1 mol·L-1HCl溶液調節(jié)pH值到2左右，于4℃靜置過夜，觀察現象。若產生白色沉淀，表明其為脂肽或脂蛋白類表面活性劑；若沒有白色沉淀產生，表明其為糖脂類表面活性劑。

紅外光譜(FTIR)分析：將生物表面活性劑粗品用KBr壓片法進行紅外光譜分析。

2結果與討論

2.1不同碳、氮源對菌株XH-2產生物表面活性劑的影響(圖1)

圖1碳、氮源對菌株XH-2產生物表面活性劑的影響

由圖1a可知，菌株XH-2以柴油為碳源時，發(fā)酵液的排油圈直徑為0；以泔水油為碳源時，排油圈直徑最大(5.1 cm)，相對應的表面張力最小(31.1 mN·m-1)。相較于葡萄糖、淀粉、甘油這些常用碳源，泔水油用作產生物表面活性劑的原料尚未見報道。以泔水油為原料生產生物表面活性劑，既能廢物利用，又節(jié)能環(huán)保，具有顯著的現實意義。由圖1b可知，當泔水油濃度為3%時，表面張力最小(30.49 mN·m-1)，排油圈直徑最大(4.8 cm)。因此，確定最適碳源為3%泔水油。

由圖1c可知，以豆粕為氮源時，發(fā)酵液的表面張力最小(29.69 mN·m-1)，相對應的排油圈直徑最大(6.1 cm)；當采用無機氮源尿素和硫酸銨時，雖然發(fā)酵液的表面張力較小，分別為30.62 mN·m-1和30.56 mN·m-1，但相對應的排油圈直徑也小，分別為3.75 cm和3.25 cm。已有利用無機氮源(如氯化銨、硝酸鈉等)進行發(fā)酵生產生物表面活性劑的相關報道，而在本研究中最適的氮源是豆粕。由圖1d可知，隨著豆粕濃度的增大，排油圈直徑增大，在豆粕濃度為5%時，排油圈直徑達到最大(6.75 cm)，表面張力最小(25.83 mN·m-1)。因此，確定最適氮源為5%豆粕。

2.2最佳接種量、鹽度、初始pH值的確定(圖2)

接種量影響微生物所產生物表面活性劑的產量。接種量過大，培養(yǎng)液中細菌的初始濃度高，過量的菌體在生長過程中因消耗大量的營養(yǎng)底物而使生物表面活性劑的產量降低；接種量過小，培養(yǎng)液中菌體濃度低，培養(yǎng)周期延長。由圖2a可知，在接種量為4%時，表面張力最小(30.39 mN·m-1)，相對應的排油圈直徑最大(5.25 cm)；接種量超過4%后，表面張力增大。因此，確定最佳接種量為4%。

圖2接種量(a)、鹽度(b)和初始pH值(c)對菌株XH-2產生物表面活性劑的影響

鹽度調節(jié)細胞內外的滲透壓，影響微生物的新陳代謝和酶的活性，鹽度過高或過低都會對微生物的新陳代謝產生不利影響。由圖2b可知，鹽度為2%時，表面張力最小(25.75 mN·m-1)，排油圈直徑最大(7.25 cm)；而鹽度低于或高于2%時，發(fā)酵液的表面張力增大，排油圈直徑減小。因此，確定菌株XH-2產生物表面活性劑的最適鹽度為2%。

微生物的生命代謝活動與環(huán)境的pH值密切相關。微生物機體內的生物化學反應一般是酶促反應，參與反應的酶都有其相應的最適pH值范圍，一般認為pH值6.5～8.5有利于微生物產生物表面活性劑。由圖2c可知，菌株XH-2在初始pH值5.0～10.0范圍內，其表面張力基本上是先減小后增大。當初始pH值為6.0時，發(fā)酵液的排油圈直徑最大(7.1 cm)，表面張力最小(25.25 mN·m-1)；當初始pH值為10.0時，發(fā)酵液的排油圈直徑最小(5.2 cm)，表面張力為26.91 mN·m-1。因此，確定菌株XH-2產生物表面活性劑發(fā)酵培養(yǎng)基的最適初始pH值為6.0。