結(jié)果和討論

細(xì)胞和探針肽的選擇

雖然細(xì)胞外環(huán)境通過影響細(xì)胞表面和整體溶液之間的質(zhì)子交換而影響細(xì)胞表面pH值，但在pH值固定的生理?xiàng)l件下，細(xì)胞表面pH值將由細(xì)胞的化學(xué)和生物學(xué)特性決定，包括細(xì)胞的質(zhì)子生產(chǎn)能力、細(xì)胞大小、細(xì)胞的大小、細(xì)胞的大小、細(xì)胞的大小、細(xì)胞的大小、細(xì)胞的大小、細(xì)胞的大小、細(xì)胞的大小、細(xì)胞的大小以及細(xì)胞的大小，以及細(xì)胞表面的pH緩沖能力。因此，在生理?xiàng)l件下，組織細(xì)胞可能具有特定的甚至可區(qū)分的表面pHs。我們測(cè)量了一組來自不同器官/組織的細(xì)胞在生理pH下的細(xì)胞表面pH值，發(fā)現(xiàn)所有受試細(xì)胞都具有不同的表面pH值（表1）。

表1：生理?xiàng)l件下測(cè)得的細(xì)胞表面pH值和電荷

裂解肽是一組陽離子肽，主要作用于細(xì)胞膜，通過引起細(xì)胞裂解殺死細(xì)胞。對(duì)裂解肽與細(xì)胞相互作用的研究表明，肽向結(jié)合平面的轉(zhuǎn)變和插入膜是裂解肽誘導(dǎo)細(xì)胞膜裂解的關(guān)鍵（6,9,11）。我們選擇具有pH依賴性細(xì)胞裂解活性的裂解肽作為探針，研究細(xì)胞表面pH對(duì)肽-細(xì)胞相互作用的潛在影響。如果pH敏感的裂解肽能夠感應(yīng)到本體溶液和細(xì)胞表面之間的pH差，從而改變肽-細(xì)胞相互作用并顯示出改變的細(xì)胞裂解活性，則可以評(píng)估細(xì)胞表面pHs的潛在藥學(xué)意義。

我們已經(jīng)開發(fā)了一種構(gòu)建具有pH依賴性細(xì)胞裂解活性的裂解肽的通用方法（9,12）。一些pH敏感的裂解肽表現(xiàn)出高達(dá)30倍的活性增加，以響應(yīng)降低的培養(yǎng)基pH（12）。由于肽對(duì)細(xì)胞膜的靜電吸引是將肽帶到細(xì)胞表面的第一步，也是關(guān)鍵步驟，因此肽上的凈電荷將對(duì)肽與細(xì)胞的相互作用產(chǎn)生顯著影響。在這方面，僅選擇具有相同（+1）電荷的pH敏感裂解肽（表2）。除了電荷外，肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)還可能顯著影響肽與細(xì)胞的相互作用。肽鏈折疊成特定構(gòu)象（通常為α螺旋結(jié)構(gòu)）證明是肽插入細(xì)胞膜的必要且能量有利的過程（6,13）。在本研究中，選擇了具有相同二級(jí)結(jié)構(gòu)（a-螺旋）的pH敏感裂解肽。這種肽和細(xì)胞選擇使我們能夠直接比較從不同細(xì)胞和肽獲得的結(jié)果。

表2：所選裂解肽的性質(zhì)

肽CL-1是一種pH不敏感的裂解肽（表2）。盡管其序列和結(jié)構(gòu)與其他pH敏感肽相似，但其細(xì)胞裂解活性幾乎不受pH的影響。本研究以肽CL-1作為陰性對(duì)照。

pH敏感裂解肽對(duì)不同表面pH值細(xì)胞的活性

首先在CHO-K1細(xì)胞上測(cè)試pH敏感裂解肽的活性，測(cè)得的細(xì)胞表面pH=8.40。由于CHO-K1的表面pH值遠(yuǎn)高于所有選定肽的過渡pH值（表2），因此所有肽在從散裝溶液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面時(shí)都會(huì)攜帶相同的負(fù)電荷（pH=7.4）。四種測(cè)試的pH敏感裂解肽在CHO-K1細(xì)胞上表現(xiàn)出較低且?guī)缀跸嗤募?xì)胞裂解能力（圖2）。

圖2：在CHO-K1細(xì)胞上測(cè)試的pH敏感裂解肽（40 lM）的細(xì)胞裂解活性。研究在無血清培養(yǎng)基（pH=7.4）中進(jìn)行。對(duì)照組未添加肽。對(duì)照空白對(duì)照組和100%裂解對(duì)照組，將細(xì)胞裂解（乳酸脫氫酶釋放）標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞死亡百分比。數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)獨(dú)立測(cè)試的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

為了研究細(xì)胞表面pH對(duì)pH敏感裂解肽與細(xì)胞相互作用的潛在影響，我們使用質(zhì)子通道調(diào)節(jié)劑8-CPT-cAMP（14）調(diào)節(jié)細(xì)胞表面pH。在正常細(xì)胞培養(yǎng)條件下，8-CPTcAMP對(duì)CHO-K1細(xì)胞的活力沒有影響（圖2）。然而，通過8-CPT-cAMP，CHO-K1的細(xì)胞表面pH值迅速（在30分鐘內(nèi)）從pH=8.4降至pH=6.90，而培養(yǎng)基pH值保持不變，保持在pH=7.4（表3）。盡管8-CPT-cAMP處理的CHO-K1細(xì)胞的表面pH值仍高于肽CL-9（pH=6.80）和肽CL-10（pH=6.60）的過渡pH值，但低于肽CL-7（pH=7.35）和肽CL-22（pH=7.15）的過渡pH值。有趣的是，四種pH敏感裂解肽對(duì)8-CPT-cAMP處理的CHO-K1細(xì)胞表現(xiàn)出不同的細(xì)胞裂解能力：肽CL-9和CL-10保持與未處理的CHO-K1細(xì)胞相同的活性，而肽CL-7和CL-22顯示出顯著增加（約兩倍）的細(xì)胞裂解活性（圖2）。肽的活性結(jié)果與未處理和8-CPT-CAMP處理的CHO-K1細(xì)胞的表面pH值相匹配，表明細(xì)胞表面pH值參與pH敏感肽的激活。

為了排除上述結(jié)果由CHO-K1細(xì)胞的某些固有特性引起的可能性，我們?cè)诹硪粋€(gè)選定的細(xì)胞A549上進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)，其細(xì)胞表面電荷與CHOK1細(xì)胞幾乎相同（表1）。由于肽將受到來自A549和CHO-K1細(xì)胞的相同拉力，靜電吸引對(duì)肽-細(xì)胞相互作用的潛在影響被最小化或消除。A549細(xì)胞的表面pH值為7.15，高于肽CL-9、CL-10和CL-22的過渡pH值，但低于肽CL-7的過渡pH值（pH值為7.35）。同樣，CL-7被證明是A549細(xì)胞上最活躍的肽（圖3）。在存在8-CPT-cAMP的情況下，A549細(xì)胞的表面pH值降低至pH=6.55（表3），低于所有受試裂解肽的過渡pH值（表1）。因此，四種pH敏感裂解肽對(duì)8-CPTcAMP處理的A549細(xì)胞的裂解活性顯著增加（圖3）。應(yīng)注意的是，與pH敏感肽不同，當(dāng)細(xì)胞被8-CPT-cAMP處理時(shí)，pH不敏感肽CL-1對(duì)A549和CHO-K1細(xì)胞的活性幾乎沒有變化（圖2和圖3）。

圖3：在A549細(xì)胞上測(cè)試的pH敏感裂解肽（40 lM）的細(xì)胞裂解活性。研究在無血清培養(yǎng)基（pH=7.4）中進(jìn)行。對(duì)照組未添加肽。對(duì)照空白對(duì)照組和100%裂解對(duì)照組，將細(xì)胞裂解（乳酸脫氫酶釋放）標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞死亡百分比。數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)獨(dú)立測(cè)試的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

細(xì)胞表面pHs影響肽活化的進(jìn)一步證據(jù)來自使用另一種質(zhì)子通道調(diào)節(jié)劑巴絲霉素A1（15）的類似研究。與8-CPT-cAMP一樣，巴非霉素A1對(duì)細(xì)胞活力的影響非常有限（圖4），但巴非霉素A1處理導(dǎo)致細(xì)胞表面pHs增加。此外，巴非霉素A1能夠逆轉(zhuǎn)8-CPT-cAMP對(duì)細(xì)胞的影響，并使細(xì)胞表面pHs恢復(fù)到正常水平或更高水平（表3）。研究表明，最初在8-CPT-cAMP處理的細(xì)胞上觀察到的肽的細(xì)胞裂解活性的升高被逆轉(zhuǎn)，因?yàn)榧?xì)胞表面pH值的增加超過了巴絲霉素A1的肽的過渡pH值（圖4）。

表3:8-CPT-cAMP-和巴非霉素A1在具有生理pH的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的細(xì)胞表面pH變化

圖4：在CHO-K1細(xì)胞（I）、用8-CPT-cAMP處理的CHO-K1細(xì)胞（II）和用8-CPT-cAMP處理的CHO-K1細(xì)胞上測(cè)試的細(xì)胞表面pHs調(diào)節(jié)PH敏感裂解肽CL-7和CL-22的細(xì)胞裂解活性，然后是巴絲霉素A1（III）。表3提供了不同處理對(duì)應(yīng)的細(xì)胞表面pHs。在所有實(shí)驗(yàn)中，肽濃度固定在40 lM。對(duì)照組未添加肽。對(duì)照空白對(duì)照組和100%裂解對(duì)照組，將細(xì)胞裂解（乳酸脫氫酶釋放）標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞死亡百分比。數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)獨(dú)立測(cè)試的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

機(jī)理研究

肽與細(xì)胞膜的相互作用包括三個(gè)步驟：（i）陽離子肽對(duì)細(xì)胞表面的靜電吸引；（ii）肽向結(jié)合平面的轉(zhuǎn)變；（iii）將肽插入細(xì)胞膜。通過研究pH敏感肽CL-7誘導(dǎo)的膜損傷動(dòng)力學(xué)，研究了肽-細(xì)胞相互作用的細(xì)節(jié)（圖5A）。CL-7誘導(dǎo)的A549細(xì)胞膜滲漏呈時(shí)間依賴性，并呈線性曲線。盡管在8-CPT-cAMP處理的A549細(xì)胞上，CL-7介導(dǎo)的細(xì)胞膜損傷在開始時(shí)遵循相同的曲線，但它偏離了線性曲線，并在培養(yǎng)15-20分鐘后加速（圖5A）。在脂質(zhì)單層膜上進(jìn)行的平行膜張力研究表明，CL-7與細(xì)胞膜的相互作用以表面張力快速增加的初始階段為特征，隨后是表面張力松弛的第二階段（圖5B），與肽與膜結(jié)合和肽插入相關(guān)膜，分別。盡管CL-7與脂膜結(jié)合是一個(gè)快速過程（3-5分鐘），但肽插入脂膜大約需要20分鐘才能完成。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果非常吻合，這意味著細(xì)胞表面pH對(duì)CL-7的顯著影響發(fā)生在肽-細(xì)胞相互作用的后期，即肽插入細(xì)胞膜。

圖5：（A）使用活/死試劑盒測(cè)定的肽CL-7誘導(dǎo)A549細(xì)胞膜損傷的動(dòng)力學(xué)。在不同時(shí)間點(diǎn)添加肽溶液后拍攝熒光圖像。計(jì)算綠色像素占總綠色和紅色像素的百分比，以估計(jì)細(xì)胞膜的完整性。（B）肽CL-7結(jié)合和插入引起脂質(zhì)單層的表面張力變化（DPPC/膽固醇/DPPS=50/10/2.5）。肽濃度保持在10 lM，脂質(zhì)單層的初始表面張力設(shè)定為33 mN/m。

我們知道，由于肽上的凈正電荷減少，含有組氨酸的pH敏感肽傾向于聚集，并且可以自組裝成具有特定結(jié)構(gòu)的肽聚集體（8,9,16）。在不同pH下聚集改變的肽是含組氨酸肽（6,9）pH依賴性活性的主要原因。使用1,8-ANS作為肽聚集體的疏水“口袋”探針的研究（圖6A）表明，肽CL-7在生理pH下經(jīng)歷了自組裝，如1,8-ANS在500 nm處的高發(fā)射強(qiáng)度和顯著藍(lán)移所示。使用SEM觀察由纖維狀超分子和納米顆粒組成的CL-7聚集體（圖6B）。然而，與其他含組氨酸的肽一樣，CL-7聚集體不穩(wěn)定，在酸性條件下溶解，因?yàn)榻M氨酸殘基的咪唑基被質(zhì)子化，并且肽分子之間的分子間排斥作用恢復(fù)（圖6A）。這種pH值控制的CL-7聚集和溶解通過在高濃度（80 lM）肽溶液中進(jìn)行的顆粒分析得到證實(shí)（圖6C）。與肽聚集體（6,9）相比，自由形式的肽具有更高的膜親和力和膜插入能力，這解釋了pH敏感裂解肽對(duì)具有酸性表面pHs的細(xì)胞的強(qiáng)烈活性（圖2、3和4）。

圖6：（A）pH值影響不同pH值下溶液（40 lM）中CL-7的聚集。1-苯胺基萘-8-磺酸（1,8-ANS）濃度固定在20 lM，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為369 nm。肽聚集溶解通過1,8-ANS發(fā)射峰在500 nm處的紅移和熒光強(qiáng)度降低來指示；（B）pH=7.4的40 lM肽溶液中形成的CL-7聚集體的掃描電子顯微鏡圖像；（C）隔夜培養(yǎng)后測(cè)量溶液中肽CL-7（80 lM）的粒徑。數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)獨(dú)立測(cè)試的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

除了肽聚集狀態(tài)外，細(xì)胞表面pH值也可能影響pH敏感肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，肽插入細(xì)胞膜通常伴隨著肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化（17）。肽鏈折疊成特定構(gòu)象，通常為α螺旋結(jié)構(gòu)，這被證明是肽插入細(xì)胞膜的必要過程（6）。盡管所有選定的pH敏感裂解肽在生理pH下均采用螺旋結(jié)構(gòu)，但當(dāng)環(huán)境pH降至肽的過渡pH以下時(shí)，它們變成隨機(jī)線圈（表2和圖7）。從無規(guī)螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪请牟迦肽さ哪芰坑欣^程（6）。因此，細(xì)胞表面pH值也可能通過改變pH敏感肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響其活性。

圖7：pHs影響肽CL-7在20mM NaAc溶液中測(cè)得的圓二色譜光譜變化。以1.0 nm的間隔從250至190 nm收集數(shù)據(jù)，每個(gè)波長(zhǎng)的積分時(shí)間為2秒。對(duì)五到十次掃描進(jìn)行平均、平滑、背景減去，并轉(zhuǎn)換為平均殘余摩爾橢圓度（h）[度數(shù)/（cm2 dmol?1）]。

pH敏感肽對(duì)腫瘤的選擇性

細(xì)胞表面pHs參與肽活化為設(shè)計(jì)具有所需細(xì)胞選擇性的治療性肽提供了新的機(jī)會(huì)。我們知道癌細(xì)胞通常具有較高的新陳代謝和較高的細(xì)胞表面緩沖能力（18）。因此，與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞可能具有更多的酸性表面pHs。在我們研究中包括的正常-癌細(xì)胞對(duì)CCD-13Lu和A549之間，人肺癌細(xì)胞A549的表面pH值（pH=7.15）比正常人肺癌細(xì)胞CCD-13Lu（pH=7.4）的表面pH值（表1）高。盡管表面pH值差異如此之小，但它確實(shí)為我們提供了一個(gè)機(jī)會(huì)來測(cè)試?yán)眉?xì)胞表面pH值來改善癌癥治療的可行性。

在細(xì)胞毒性研究中，選擇了研究充分的pH敏感裂解肽PTP-7b（FLGALFKALSHL）（6,9）。由于PTP-7b的過渡pH（pH=7.25）低于A549的表面pH，但高于CCD-13Lu，因此裂解肽PTP-7b對(duì)A549的毒性可能比對(duì)CCD-13Lu細(xì)胞的毒性更大。選擇PTP-7b的親本肽PTP-7（FLGALFKALSKLL），一種pH不敏感的裂解肽（6,9）作為對(duì)照。如圖8所示，盡管肽PTP-7對(duì)兩種細(xì)胞的活性相同，但pH敏感肽PTP-7b對(duì)A549的毒性大約是對(duì)CCD-13Lu的三倍。

圖8:pH敏感肽PTP-7b（FLGALFKALSHLL）對(duì)正常-癌細(xì)胞對(duì)CCD-13Lu和A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性（MTT試驗(yàn)）。以pH不敏感肽PTP-7（FLGALFKALSKLL）作為對(duì)照。數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)獨(dú)立測(cè)試的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

我們知道，與蛋白質(zhì)相比，肽具有一些獨(dú)特和優(yōu)越的特性（19）。生物活性肽對(duì)生物體的功能和條件有積極的影響，并顯示出對(duì)人類健康有益的特性。在過去的十年中，肽的研究得到了迅速的發(fā)展，而且這種發(fā)展很可能會(huì)繼續(xù)下去。獨(dú)特和特異的細(xì)胞表面pH值可能是設(shè)計(jì)具有所需細(xì)胞特異性和選擇性的藥物和治療肽的新靶點(diǎn)。

致謝

這項(xiàng)工作得到了美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院GM081874撥款的支持。陳先生是創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)博士研究生獎(jiǎng)學(xué)金的獲得者。